Nonradioactive Digoxigenin-labeled DNA Probes for the Detection of Five RNA Species Present in Beet Necrotic Yellow Vein Virus

Complementary DNA (cDNA) clones corresponding to each of five distinct RNA species of beet necrotic yellow vein (BNYVV) were synthesized and identified. The sizes of each cDNA clone for RNAs 1,2,3,4 and 5 molecules were 3.0, 1.7, 1.8, 1.5 and 1.4 kbp, respectively. cDNA inserts to RNA 2 were covered at a part of the 3'regions, and those of RNAs 3,4 and 5 were almost full-length. The plasmids containing each of cDNA inserts were labeled with digoxigenin by the random priming method. Northern blot hybridization tests showed that individual probes hybridized specially to each of the five RNAs. Good results were obtained with 1 to 10 ng of RNA as a mixture of five RANs, but the probe to RNA 3, RNA 4 or RNA 5 gave a weak signal with hererologous RNAs when more than 10 ng RNA was used. In dot blot hybridization, the limit of detection was about 10 pg RNA, but if a higher content of RNA was spotted, cross reaction occurred using heterologous RNAs. For laboratory and field isolates of BNYVV, each of RNAs 3,4 and 5 was easily detected by Northern blot hybridization in total nucleic acids extracted from Tetragonia expansa leaves inoculated mechanically, but not from roots of sugar-beet plants inoculated by the fungus Polymyxa betae. However, satisfactory results were obtained with partially purified or concentrated preparations from roots. These findings indicate that the digoxigenin-labeled probes are useful for the identification and detection of RNAs contained in field and laboratory isolates of BNYVV.

テンサイそう根ウイルス（Beet nectotic yellow vien virus,BNYVV）に含まれる5種類のRNAのcDNAをクローニングした。得られたcDNAクローンのサイズは次の通りであった：RNA－1、3.0kbp；RNA－2、1.7kbp；RNA-3、1.8kbp；RNA－4、1.5kbp；RNA－5、1.4kbp。RNA-1とRNA-2由来のcDNAクローンは、それぞれ全ゲノムの3’末端側45％と35％を占めていた。RNA-3、RNA－4およびRNA－5からのcDNAクローンはほぼ全長であった。各cDNAクローンをジゴキシゲニン標識し、Northern blot hybridization でウイルスRNAの検出条件を検討した結果、試料はホルマリン・ホルムアルデミド変性、プローブのソニケーション、プローブ量は50ng/ml,ホルムアミド存在下の温度は42℃で行うのが最適であった。BNYVVの4～5種のRNAを検出するためには、全RNA量として1～10ngが適当であった。全RNA量が20ng以上では、RNA-3、RNA-4およびRNA-5の間でお互いにわずかに反応が認められた。この原因は、プローブの3’末端にみられる共通配列によることが確かめられた。Dot blot hybridization によるウイルスRNAの検出感度は、10pgであったが、試料の濃度が高くなるにつれて、RNA-3、RNA-4およびRNA-5の間でお互いに反応が認められた。各種BNYVV分離株を用いて、それらに存在するRNA組成とサイズをNorthern blot hybridization により解析したところ、検定植物ツルナ接種葉の場合には、直接全核酸を調整した試料からウイルスRNAの検出が可能であったが、Polymyxa betae 菌で接種されたテンサイの根の場合には、ウイルス濃度に応じて部分純化または濃縮した試料から核酸を調整する必要があった。このような条件下で、ほ場および室内分離株に存在するBNYVV RNA種およびそれらの欠失変異株を確実に検出することができた。