ジギトニン処理透過性細胞内におけるSV40クロマチンDNA複製の解析

真核細胞におけるクロマチンDNAの複製とその調節機構を研究するために, SV40感染細胞を低濃度のジギトニン処理し,基質透過性とした細胞(permeable cell)の超微構造と同細胞内におけるSV40クロマチンDNA複製系の諸条件を検討し,基質要求性と阻害剤や制癌剤の影響を解析した.その結果, ①至適なジギトニン濃度(100～150μg/ml),処理温度(25℃),塩濃度(50～100μM KCl),蔗糖濃度(0.1～0.15M), Mg(2+)濃度(5～7mM),反応温度(30°～37℃)などの基礎的諸条件を決定した. ②このジギトニン処理透過性細胞は超微構造的に細胞膜は障害されているが,他の内膜系や核クロマチンは比較的よく保たれている. ③この透過性細胞系では,細胞質抽出液を加えなくても,基質としての4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(d ATP, d CTP, d GTP,各0.1mM, dTTP, 0.01mM)の他, ATP(2～5mM)とMg(2+) (5mM)の添加で効率のよいDNA合成が行なわれる. ④EDTA, NEM,アフィディコリン, ara CTPでDNA合成がほとんど完全に阻害され, dd TTPでは全く阻害されないので,この系のDNA合成は複製的DNA合成である. ⑤アドリアマイシンなどの制癌剤でSV40 DNAの複製が直ちに強く阻害されることを見出した.したがって,本実験系は真核細胞におけるクロマチンDNAのin vitro複製の研究のみならず,アドリアマイシンなどのDNA合成阻害制癌剤の作用を調べる上に極めて有用な実験系として役立つものと考えられる.

The ultrastructure of digitonin-treated permeable cells and various conditions for DNA replication of SV40 chromatin as well as the requirements for and inhibitors of DNA synthesis were analyzed. Electron microscopy of the permeable cells revealed that the plasma membrane was injured but inner membranes and nuclear chromatin remained relatively intact. Efficient DNA replication of SV40 chromatin in the present system requires the addition of dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP and Mg(2+). Complete replication of SV40 chromatin DNA occurs without addition of cytosol. The DNA synthesis is almost completely inhibited by ethylenediamin-tetraacetic acid, N-ethylmaleimide, aphidicolin, and arabinosyl-cytidine triphosphate but not by 2', 3'-dideoxythymidine -5'-triphosphate, showing that the DNA synthesis is replicative. Adriamycin strongly inhibits the DNA replication, and the addition of adriamycin in the process of reaction immediately stops the DNA replication. Thus, the digitonin-treated permeable cell system serves as a useful system for studying in vitro replication of chromatin DNA in eukaryotic cells as well as for studying the in vitro action of adriamycin and other antitumor drugs which inhibit DNA replication.